一、蛋白表达的基本原理
蛋白表达(Protein Expression) 是指细胞根据遗传信息合成蛋白质的过程。
在自然状态下,DNA 上的基因通过 转录(Transcription) 产生信使 RNA(mRNA),
随后经过 翻译(Translation) 在核糖体上形成多肽链,最终折叠为具有特定功能的蛋白质。
在实验室与产业应用中,研究人员利用重组DNA技术,将目标基因插入至合适的载体,并导入宿主细胞,使宿主系统在人工调控条件下高效生产外源蛋白,这种过程即为重组蛋白表达。其核心在于通过人为调控基因表达的时机、强度与环境,实现特定蛋白的大量制备。
二、蛋白表达的主要步骤
一个完整的蛋白表达系统的构建与运行,大致包括以下关键环节:
1.基因设计与载体构建
根据目标蛋白的特性(来源、长度、修饰等),选择合适的载体系统。常见载体包含强启动子(如 T7、CMV)、多克隆位点(MCS)和融合标签(如 His、GST、MBP),以确保基因能被正确转录和翻译。
2.宿主选择与转化
常用宿主包括原核细胞(如 E. coli)、真核细胞(如 HEK293、CHO)、酵母或昆虫细胞等。转化后,目标基因在宿主内整合或以质粒形式存在。
4.诱导与表达调控
当宿主生长到适当阶段后,通过化学(如 IPTG)、温度或营养信号诱导启动转录。控制诱导强度与时间,可平衡表达量与蛋白可溶性。
5.蛋白提取与纯化
表达后的蛋白可位于胞质、周质或培养基中。
通过离心、超声破碎与层析技术(如Ni-NTA亲和层析)获得高纯度目标蛋白。
6.验证与功能分析
使用 SDS-PAGE、Western blot、质谱等方法检测蛋白表达的正确性、纯度和活性。
三、常见蛋白表达系统对比
不同宿主系统具有差异化的特征与适用范围。
合理选择系统是获得理想蛋白产物的关键。
表达系统 |
常用宿主 |
特点 |
优势 |
局限性 |
---|---|---|---|---|
原核表达系统 |
E. coli |
成熟、快速、高效 |
成本低、操作简便、产量高 |
缺乏真核修饰,易形成包涵体 |
酵母表达系统 |
Pichia pastoris、S. cerevisiae |
真核修饰部分具备 |
可分泌表达、适合放大 |
糖基化模式不同于哺乳动物 |
昆虫细胞系统 |
Sf9、Hi5 |
基于杆状病毒载体 |
高表达量、修饰接近哺乳动物 |
培养成本较高 |
哺乳动物表达系统 |
HEK293、CHO |
完整真核修饰 |
适合复杂蛋白及抗体表达 |
周期长、成本高 |
无细胞表达系统 |
E. coli 提取液或 Rabbit Lysate |
体外反应系统 |
快速、可控、适合筛选 |
成本高、产量有限 |
由此可见,原核系统适用于基础研究与结构分析,而真核系统更适合制备具有生物活性的治疗性蛋白。
四、影响蛋白表达的关键要素
1.启动子与调控元件
启动子强度直接决定转录水平。T7 系统适用于高表达,Lac/Tac 启动子则更平衡。若目标蛋白有毒性,可选择温和诱导型启动子。
2.融合标签设计
通过 His、GST、MBP 等融合标签可提高蛋白可溶性并简化纯化流程,标签应设计在不影响蛋白活性的位置,并可在纯化后切除。
3.宿主菌株优化
特殊菌株(如 Rosetta、Origami、BL21(DE3)pLysS)可提供稀有 tRNA 或改善折叠环境。对真核系统,可选择高产稳定株或转瞬性表达模式。
4.表达条件调节
温度、诱导时间、培养基配方等因素会显著影响表达水平与蛋白质量。低温诱导常有助于可溶性表达。
5.密码子优化与序列改造
不同物种偏好不同的密码子。通过优化基因序列,使之匹配宿主的翻译体系,可显著提升表达效率。
五、应用方向与技术前景
蛋白表达技术 已成为现代生命科学与生物制造的基础支撑。其应用范围涵盖:
基础研究:蛋白功能验证、酶学研究、结构解析;
药物开发:抗体、重组激素、细胞因子、疫苗抗原生产;
工业应用:食品酶、洗涤酶、环境修复酶等的规模化制备;
诊断检测:用于抗原、抗体及标准品生产。
蛋白表达的核心在于理解基因调控与宿主系统的相互作用。从基因设计到蛋白纯化,每个环节都影响最终产物的结构与功能。掌握表达原理、理解关键要素、善用不同系统的特性,是实现高质量重组蛋白表达的关键。