随着纳米抗体在肿瘤治疗、病原体检测、工业酶固定化等领域的应用拓展，对羊驼免疫及 VHH 筛选的需求持续攀升。羊驼因饲养、运输、免疫成本显著高于小鼠、兔子，市场上逐渐出现 “二次免疫” 操作 —— 即利用已免疫过其他抗原的羊驼进行新抗原免疫，试图降低成本。然而，这种 “看似节约” 的方式会从免疫应答、文库质量、抗体特性到知识产权等多维度引入风险，为纳米抗体下游开发埋下隐患。本文将系统拆解羊驼二次免疫的六大核心风险，强调 “零免疫背景” 羊驼对纳米抗体制备的必要性。
一、免疫干扰：既往抗原引发的 “应答偏差”
已免疫羊驼的免疫系统存在 “记忆残留”—— 针对既往抗原的记忆 B 细胞会优先激活，干扰新抗原的特异性免疫应答，导致表位识别偏移与交叉反应，且风险因 “既往抗原未知” 而进一步放大。
1. 表位偏好性偏移，错失关键靶点
羊驼免疫系统对新抗原的表位识别会受既往免疫 “训练” 的影响，优先针对非关键表位产生抗体，而非治疗或检测所需的核心表位。例如：
- 在新冠病毒刺突蛋白（S 蛋白）免疫中，零免疫背景羊驼产生的 VHH 中，60%-70% 靶向 RBD 区（中和病毒的关键表位）；而经其他冠状病毒（如 MERS）免疫的羊驼，仅 20%-30% 的 VHH 靶向 RBD 区，其余多结合 S2 亚基（非中和表位），导致筛选出的纳米抗体无抗病毒活性。
- 针对 GPCR 类靶点（如 EGFR），二次免疫羊驼的抗体多结合胞外区非活性构象表位，无法阻断受体信号通路，而零免疫羊驼的抗体更易识别活性构象关键位点。
2. 交叉反应干扰，假阳性率飙升
既往免疫产生的预存抗体可能与新抗原存在结构相似性，导致非特异性结合，增加筛选假阳性。例如：
- 曾免疫过 HER2 抗原的羊驼，再免疫 EGFR 时，部分抗 HER2 VHH 会因 HER2 与 EGFR 的同源结构（约 40% 氨基酸相似），与 EGFR 非特异性结合，ELISA 检测假阳性率从 5% 升至 35%，需额外通过竞争结合实验、表位 mapping 验证，延长研发周期 2-3 周。
3. 既往抗原未知，风险不可控
核心隐患在于 “信息不对称”—— 部分客户为保护靶点隐私，会隐瞒羊驼既往免疫的抗原类型、标签（如 His、Fc），导致新抗原与既往抗原可能存在交叉（如同一蛋白家族、相似标签），引发免疫失败：
- 若新抗原为 “His 标签 - 蛋白 A”，而羊驼曾免疫 “His 标签 - 蛋白 B”，则免疫系统会优先产生抗 His 标签的抗体，而非抗蛋白 A 的特异性 VHH，最终抗体库中 90% 以上为抗标签抗体，无法获得目标分子。
二、免疫文库污染：非目标抗体挤占 “有效空间”
免疫干扰会直接导致免疫文库被既往抗原的 VHH 污染，目标抗体比例骤降，筛选效率大幅降低，甚至遗漏高亲和力候选分子。
1. 目标抗体占比不足，文库 “失效”
二次免疫羊驼构建的噬菌体展示文库中，针对新抗原的 VHH 占比通常低于 30%，其余为针对既往抗原的非目标 VHH。例如：
- 某团队用曾免疫过 TNF-α 的羊驼免疫 IL-6，构建的文库中仅 25% VHH 能与 IL-6 结合，其余 75% 均为抗 TNF-α VHH；而零免疫羊驼的 IL-6 文库中，目标 VHH 占比可达 60%-70%。
2. 筛选成本翻倍，低丰度抗体流失
为排除非目标 VHH，需增加 “预清除” 步骤（用既往抗原吸附文库），或进行多轮筛选（从 3 轮增至 5-6 轮），工作量增加 2-3 倍；同时，低丰度但高亲和力的目标 VHH 可能在预清除中被误吸附，导致优质候选分子流失。某研究显示，二次免疫文库经预清除后，高亲和力 VHH（KD<1nM）的回收率仅为零免疫文库的 40%。
三、抗体多样性受限：结构优势丧失
羊驼经多次免疫后，B 细胞经历反复克隆选择，VHH 基因库的多样性会显著降低，尤其是框架区（FR）与互补决定区（CDR）的结构多样性，直接削弱纳米抗体的核心优势。
1. FR 区同源化，结构单一化
既往免疫会导致 VHH 的 FR 区（维持抗体结构稳定的关键区域）基因趋同，不同 VHH 的 FR 序列相似度从 40%-60% 升至 70%-80%，限制抗体的空间构象多样性。例如：
- 二次免疫羊驼的 VHH 中，FR2 区的 “E44-R45-G47” 保守序列占比超 90%，而零免疫羊驼中该序列占比仅 50%，其余为 “E44-K45-A47”“Q44-R45-G47” 等变异类型，更易形成适配复杂表位的构象。
2. CDR3 缩短，表位识别能力下降
CDR3 是 VHH 结合抗原的核心区域，其长度（通常 10-20 个氨基酸）直接决定表位覆盖范围。二次免疫会导致 CDR3 平均缩短 2-3 个氨基酸，且序列保守性增加：
- 零免疫羊驼的 VHH CDR3 平均长度为 15-16 个氨基酸，可形成 “凸环” 结构深入抗原隐蔽表位（如酶活性中心）；而二次免疫羊驼的 CDR3 平均长度仅 12-13 个氨基酸，难以结合复杂表位，导致抗体亲和力下降 1-2 个数量级（从 nM 级降至 μM 级）。
四、人源化改造成本激增，亲和力优化空间压缩
二次免疫羊驼的 VHH 携带更多 “驼源特征”，且可能积累随机突变，增加人源化改造难度；同时，既往免疫可能使抗体亲和力接近 “平台期”，后续优化空间受限。
1. 免疫原性热点残留，改造步骤增加
既往抗原刺激会导致 VHH 表面暴露出更多羊驼特异性表位（如 FR2 区的驼源氨基酸），人源化时需通过定点突变、CDR 移植消除：
- 零免疫羊驼的 VHH 人源化通常需 3-5 个突变位点，改造周期 4-6 周；而二次免疫羊驼的 VHH 需 8-10 个突变位点，改造周期延长至 8-10 周，且突变可能破坏抗体结构，导致稳定性下降（Tm 值降低 5-8℃）。
2. 糖基化干扰，表达成本翻倍
部分既往免疫的 VHH 为适配特定抗原，会保留 N - 糖基化位点（Asn-X-Ser/Thr），而原核表达系统（如大肠杆菌）无法实现糖基化，需更换为真核系统（如 CHO 细胞）：
- 真核表达的成本是原核的 2-3 倍，且表达量降低（从 200-300mg/L 降至 50-100mg/L），大幅推高生产费用。
3. 预存突变限制亲和力优化
二次免疫的 VHH 可能积累非功能性突变（如 FR3 区的 Pro→Leu），导致亲和力已接近平台期（KD≈10⁻⁸M），进一步优化需引入高风险突变（如 CDR 插入氨基酸），但可能导致抗体解折叠，成功率仅 30% 左右，远低于零免疫 VHH 的 60%-70%。
五、功能性设计受限，免疫原性不可控
二次免疫 VHH 的结构特性（如糖基化、构象刚性）会限制其工程化改造，且免疫原性风险不可控，影响临床转化。
1. 结构刚性增加，融合改造困难
既往免疫使 VHH 的构象趋于固定，难以与其他功能分子（如细胞毒素、细胞因子）融合：
- 零免疫羊驼的抗 PD-1 VHH 与 IL-2 融合后，仍能保持 80% 以上的 PD-1 结合活性；而二次免疫羊驼的抗 PD-1 VHH 融合 IL-2 后，活性仅保留 40%-50%，因构象刚性导致融合后表位结合位点被遮蔽。
2. 表位冲突，双抗设计失败
在双特异性抗体设计中，二次免疫 VHH 的表位结合模式可能与新靶点产生空间位阻：
- 某团队用二次免疫羊驼的抗 CD3 VHH 与抗 HER2 VHH 构建双抗，因抗 CD3 VHH 的结合表位靠近 CD3 的跨膜区，与抗 HER2 VHH 的空间构象冲突，导致双抗无法同时结合两个靶点，而零免疫 VHH 构建的双抗成功率达 80%。
3. 糖基化引发免疫原性风险
二次免疫 VHH 的 N - 糖基化位点出现频率是零免疫组的 3 倍，这些糖基化修饰可能被人体免疫系统识别为 “外源糖链”，引发抗药抗体（ADA）反应：
- 临床前数据显示，二次免疫 VHH 的 ADA 发生率约 15%-20%，而零免疫 VHH 经人源化后，ADA 发生率可降至 5% 以下，显著提升临床安全性。
六、知识产权风险凸显，整体成本反升
二次免疫看似降低了短期饲养成本，实则因风险导致长期成本激增，且可能引发专利纠纷。
1. 专利侵权风险，项目停滞
全球已公开的羊驼抗体专利中，41% 涉及特定抗原的免疫方案，若使用已免疫羊驼开发的 VHH 与现有专利序列同源性≥85%，可能落入专利保护范围。例如：
- 某企业用二次免疫羊驼开发的抗 EGFR VHH，因与已授权专利的 VHH FR 区同源性达 90%，被起诉侵权，项目停滞 6 个月，赔偿金额超千万元。
2. 整体成本增加 30%-60%
二次免疫的隐性成本远超短期节约：
- 时间成本：筛选周期从 4 周延长至 8 周，验证实验（如交叉反应、表位 mapping）增加 3-4 项；
- 失败成本：约 20% 的二次免疫项目因抗体质量不达标需重新免疫，重复投入的成本是零免疫的 1.5 倍；
- 生产风险：工程化改造后的抗体批次稳定性下降，失败率从 5% 升至 15%，进一步推高成本。
总结
羊驼二次免疫看似是 “成本优化”，实则是引入多重风险的 “短视选择”—— 从免疫应答偏差到文库污染，从抗体多样性丧失到知识产权纠纷，每一项风险都可能导致研发周期延长、成本激增，甚至项目失败。在纳米抗体向临床转化的关键阶段，选择 “零免疫背景” 羊驼，从源头保障抗体的特异性、多样性与安全性，才是兼顾研发效率与临床价值的最优解。