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近日，英国剑桥大学Courtney W. Hanna团队和西班牙马德里自治大学Vicente Perez-Garcia团队合作，在Cell Stem Cell杂志发表题为《Ectopic expression of DNMT3L in human trophoblast stem cells restores features of the placental methylome》的研究论文，研究通过微量全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）、染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）、转录组测序（RNA-seq）等揭示了人滋养层干细胞（hTSCs）的DNA甲基化及其在胎盘发育中的作用，并证明DNMT3L能够恢复hTSCs中胎盘的部分甲基化区域（PMDs）和调控滋养层细胞分化，为胎盘功能及相关妊娠疾病的研究提供了新依据。
标题：Ectopic expression of DNMT3L in human trophoblast stem cells restores features of the placental methylome（人滋养层干细胞中DNMT3L异位表达可恢复胎盘甲基化表征）
发表时间：2025年2月6日
发表期刊：Cell Stem Cell
影响因子：IF20.4/Q1
技术平台：微量WGBS、ChIP-seq、RNA-seq等（易基因金牌技术）
作者单位：英国剑桥大学、西班牙马德里自治大学
DOI：10.1016/j.stem.2024.12.007
胎盘的DNA甲基化图谱具有特异性且广泛存在部分甲基化区域（PMDs）。胎盘“甲基化组”在哺乳动物中高度保守，是许多癌症鉴定的共有表征，与妊娠并发症的关联受到广泛研究。人类滋养层干细胞（hTSCs）为胎盘功能研究提供了巨大潜力，有助于更好理解表观遗传特征；然而hTSCs表观基因组是否能够模拟原代滋养层细胞不完全清楚。本研究发现，与滋养层外细胞（Trophectoderm，TE）和第一孕期（孕早期，孕1-12周）滋养层细胞（Cytotrophoblast，CTBs）相比，hTSCs表现出不典型的甲基化组。无论细胞来源、氧气水平还是培养条件如何，hTSCs均显示出在转录基因体内的局部DNA甲基化，并且完全失去PMDs。与早期人类滋养层细胞不同，hTSCs的DNMT3L表达显著缺失，而小鼠滋养层细胞中PMDs的建立依赖于DNMT3L。研究证明在hTSCs中异位表达DNMT3L可以恢复胎盘PMDs的DNA甲基化，支持DNMT3L在人类早期胚胎发生过程中滋养层发育的de novo甲基化保守。
- hTSCs与第一孕期滋养层细胞（1st CTBs）相比，在胎盘PMDs区域表现出低甲基化。
- 细胞来源和培养条件对hTSCs的DNA甲基化模式作用有限。
- DNMT3L在人类滋养层细胞的de novo甲基化可能窗口期间表达。
- 在hTSCs中异位表达DNMT3L可恢复胎盘PMDs的DNA甲基化。
图形摘要
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研究方法
样本收集与处理：从6日龄人类囊胚中收集滋养层外细胞（TE），并从第一孕期胎盘中分离出滋养层细胞（CTBs），并培养囊胚（BTS11）和孕早期CTB（CT29）的hTSCs。
DNA甲基化分析：利用微量WGBS技术，分析TE、CTBs和hTSCs的全基因组DNA甲基化模式。将这些细胞类型的DNA甲基化图谱与已发表的数据集进行比较，揭示hTSCs与原代滋养层细胞之间的差异。
细胞培养与分化：研究了不同培养条件（如氧气浓度、培养基类型）对hTSCs DNA甲基化模式的影响。诱导hTSCs分化为合体滋养层细胞和细胞滋养层细胞，评估DNA甲基化模式变化。
DNMT3L过表达实验：通过慢病毒介导的DNMT3L过表达，研究DNMT3L对hTSCs DNA甲基化模式的影响，特别是对胎盘PMDs的恢复作用。并评估DNMT3L过表达hTSCs在类器官培养中的分化能力。
ChIP-seq：分析hTSCs中的组蛋白修饰，特别是H3K4me3、H3K36me3和H3K27me3的分布。
基因表达分析：通过RNA-seq和RT-qPCR技术检测hTSCs中的基因表达水平。
结果图形
（1）人滋养层干细胞（hTSCs）表现出与滋养外胚层细胞（TE）和CTBs的差异DNA甲基化特征表征
研究发现，hTSCs的DNA甲基化模式与TE和CTB存在显著差异。与TE和CTB相比，hTSCs显示出较低的DNA甲基化水平，且胎盘特有的部分甲基化区域（PMDs）缺失，这些PMDs在CTBs中表现为部分甲基化状态（20%-60%）。此外，hTSCs的DNA甲基化主要集中在转录基因体内，与基因表达水平呈正相关（Figure 1）。这一结果表明，hTSCs的DNA甲基化模式与原代滋养层细胞存在显著差异，可能影响其功能和分化能力。
图1：与体内细胞类型相比，hTSCs表现出特异性DNA甲基化谱
（A）基于常染色体100-CpG窗口的DNA甲基化数据，生物学重复和技术重复样本聚集模式的主成分分析。hTSCs的甲基化谱与TE和1st CTB均不重叠，表明其甲基化图谱具有特异性。
（B）截图显示培养的naive和primed hESCs、来自囊胚的hTSCs（BT-hTSCs，n=1）以及来自第一孕期CTBs的hTSCs（CT-hTSCs，n=1）的DNA甲基化模式，与精子（n=3）、卵母细胞（N=2）、囊胚（n=1）、滋养层外细胞（mural TE，n=2）、第一孕期CTBs（n=5）和第三孕期胎儿单核细胞（3rd Mono，n=3）的生物学重复样本的平均DNA甲基化水平进行比较。
（C）左侧散点图显示了滋养层外细胞（mural TE，n=2）与hTSCs（n=2）的常染色体100-CpG窗口的平均DNA甲基化水平，右侧散点图显示了第一孕期CTBs（n=5）与hTSCs（n=2）的比较。
（D）豆点图显示TE（n=2）、BT-hTSCs（n=1）和CT-hTSCs（n=1）的100-CpG窗口的DNA甲基化水平，与第一孕期CTBs（n=5）进行比较，覆盖范围从未甲基化区域（<20%）到部分甲基化区域（20%-60%）再到高甲基化区域（>60%）。
（E）箱线图显示了hTSCs中H3K4me3（n=5）、H3K36me3（n=2）、H3K27me3（n=3）和H3K9me3（n=3）的组蛋白修饰平均富集水平：H3K4me3（活性标记）富集于未甲基化区域；H3K36me3（转录相关）与基因体甲基化共定位；H3K27me3和H3K9me3（抑制性标记）在hTSCs的PMDs中富集度低于体内CTBs。
（F）截图显示了hTSCs（n=3）和第二孕期CTBs（2nd CTB，n=2）的H3K27me3富集（RPKM）水平。图中还标注胎盘PMDs和在CTBs中也富集H3K27me3的PMDs的子集，以及hTSCs和CTBs中的H3K27me3富集区域。
（2）培养条件对hTSCs的DNA甲基化模式影响有限
研究发现，不同的培养条件（如氧气浓度、培养基类型、3D培养等）对hTSCs的DNA甲基化模式影响有限。结果显示，尽管在某些条件下（如低氧环境）DNA甲基化水平有轻微变化，但这些变化不足以恢复胎盘PMDs（Figure 2）。这表明hTSCs的DNA甲基化模式相对稳定，且不易通过常规培养条件进行调控。
图2：不同细胞来源、培养条件和氧浓度均未能恢复胎盘甲基化表征
- 示意图展示hTSCs的不同来源，包括囊胚来源①、细胞滋养层细胞来源②以及从naive hESCs转分化而来③，以及本研究中使用的培养方法。
- 豆点图显示人类卵细胞（n=2）、精子（n=3）、囊胚（n=1）、滋养层外细胞（n=2）、naive hESCs（n=1）、转分化hTSCs（tdhTSCs，n=2）、BT-hTSCs（n=1）、CT-hTSCs（n=1）、低氧条件下的2D培养hTSCs（2D low O2，n=2）、滋养层类器官培养基中的2D培养hTSCs（2D TOM，n=2）、作为类器官培养的hTSCs（hTSC-Org，n=2）以及低氧条件下的hTSC-Orgs（n=2）、第一孕期CTBs（n=5）、primed hESCs（n=1）和第三孕期胎儿单核细胞（3rd Mono，n=3）的常染色体100-CpG窗口平均DNA甲基化水平。
- 主成分分析显示常染色体100-CpG窗口的DNA甲基化，不同技术重复和生物学重复呈现聚类模式。(D) 截图显示每种hTSC条件下的100-CpG窗口的DNA甲基化水平，覆盖范围为10号染色体上的3.7 Mbp区域。图中还标注第一孕期CTBs中定义的胎盘PMDs。
(E) 箱线图显示各样本中胎盘PMDs的100-CpG窗口的平均DNA甲基化水平。
(F) 箱线图显示所有样本中经典印记DMRs（左，不同组织中印记的DMRs）和胎盘特异性印记DMRs（右）的平均DNA甲基化水平。
（3）DNA甲基转移酶（DNMT）活性改变可能支持hTSCs中非典型DNA甲基化
研究发现，hTSCs中DNA甲基转移酶（DNMTs）的表达模式与原代滋养层细胞不同。hTSCs中DNMT3B表达较高，而DNMT3A和DNMT3L表达较低。DNMT3B主要在转录基因体内发挥作用，这与hTSCs中DNA甲基化的基因体定位一致。通过单细胞RNA测序分析，研究者发现hTSCs的DNMT表达模式与早期胚胎发育中的滋养层细胞相似，但DNMT3L表达缺失。这表明DNMT3L缺失可能是hTSCs中DNA甲基化模式异常的主要原因。
图3：hTSCs中的DNA甲基化富集在具有H3K36me3标记的转录基因体中，并与DNMT3B表达相关。
- hTSCs中平均DNA甲基化（n=2）、H3K36me3富集（n=2）和基因表达（n=5）截图。
- 箱线图显示hTSCs中基因表达水平的十等分位的基因DNA甲基化水平。
- 箱线图显示hTSCs中基因表达水平的十等分位的基因H3K36me3水平。
- 箱线图显示hTSCs（n=5）中DNMT3A、3B和3L的mRNA表达水平。
- UMAP图显示来自人类胚胎和干细胞的单细胞RNA-seq数据，按细胞类型着色。
- UMAP图（E）上显示了NMT3A、3B和3L的表达水平。
（4）在hTSCs中异位表达DNMT3L可恢复胎盘PMDs
通过慢病毒介导的DNMT3L过表达实验，研究者发现DNMT3L的异位表达能够显著恢复hTSCs中的胎盘PMDs。与对照组相比，DNMT3L过表达的hTSCs显示出更高的DNA甲基化水平，特别是在PMDs区域。此外，DNMT3L过表达还恢复了H3K27me3标记的CpG岛和印记区域的中间甲基化水平。这表明DNMT3L在胎盘PMDs的建立中起着关键作用。
图4：DNMT3L异位表达可恢复胎盘PMD
- hTSCs中DNMT3L慢病毒表达系统示意图，展示载体设计（上）和用于获得稳定表达DNMT3L的hTSCs以及转导对照细胞（下）的实验流程。
- 对照（Stuffer）细胞和DNMT3L过表达（DNMT3L-OE）hTSCs的DNMT3L表达RT-qPCR分析。
- Western blot分析显示对照组与DNMT3L-OE hTSCs中的DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L和TUBULIN，证实DNMT3L在DNMT3L-OE hTSCs中的表达。
- 主成分分析显示基于常染色体100-CpG窗口的DNA甲基化，揭示DNMT3L-OE hTSCs与第一孕期CTBs最为接近。
- BT-hTSCs（n=1）、CT-hTSCs（n=1）、对照hTSCs（n=3实验重复）和DNMT3L-OE hTSCs（n=3实验重复）中胎盘PMDs内100-CpG窗口与第一孕期CTBs（n=5）比较的平均DNA甲基化水平箱线图。
- T-hTSCs、CT-hTSCs、对照hTSCs、DNMT3L-OE hTSCs和第一孕期CTBs中3号染色体3.7 Mbp区域的100-CpG窗口的平均DNA甲基化水平截图，特别是在PMDs内DNA甲基化水平增加。图中还标注在第二孕期CTBs或hTSCs中定义的H3K27me3区域、在第一孕期CTBs中定义的胎盘PMDs以及与对照组相比DNMT3L-OE中高甲基化的差异甲基化区域（DMRs）。
5. DNMT3L过表达的hTSCs具有相似自我更新能力，但在类器官培养中分化能力受损
DNMT3L过表达的hTSCs在2D培养中显示出与对照组相似的自我更新能力，但在3D类器官培养中，其分化为合体滋养层细胞（STBs）的能力受到抑制。研究发现，DNMT3L过表达的hTSCs在类器官培养中表现出CREB蛋白水平降低和CREB激活减少，这可能与CRE序列基序的超甲基化、CREB蛋白水平降低以及STB分化相关的信号通路受损有关。这一结果表明，DNMT3L的持续表达可能影响hTSCs的分化能力，特别是在STBs的形成过程中。
图5：DNMT3L过表达（DNMT3L-OE）hTSCs在自我更新和细胞身份上与对照hTSCs相似
- 图像显示DNMT3L过表达（DNMT3L-OE）与对照hTSCs相似的细胞形态。
- 条形图显示对照hTSCs和DNMT3L-OE中干细胞标记物TEAD4、TP63、GATA3和ELF5（上）以及上皮细胞标记物CDH1、EPCAM、TJP1和VCL（下）的相对表达水平RT-qPCR。
- 热图显示hESC基因OCT4（POU5F1）和NANOG以及hTSC基因ELF5的转录起始位点100-CpG窗口的DNA甲基化。展示primed hESCs（n=1）、naive hESCs（n=1）、tdhTSCs（n=2）、BT-hTSCs（n=1）、CT-hTSCs（n=1）、低氧条件下2D培养的hTSCs（n=2）、TOM（2D TOM）中的hTSCs（n=2）、hTSC-Org（n=2）以及低氧条件下的hTSC-Orgs（n=2）、对照hTSCs（n=3实验重复）和DNMT3L-OE hTSCs（n=3实验重复）的平均值。
- 直方图展示DNMT3L-OE和对照hTSCs、JEG3细胞（阳性对照）以及阴性对照中HLA-G、HLA-C、HLA-A2和泛HLA-A,B,C的表达情况。
图6：在类器官培养中，DNMT3L过表达hTSCs无法有效分化为合体滋养层细胞
- 示意图展示在hTSCs中诱导合体滋养层细胞（STB）形成的信号级联反应。具体而言，STB分化可以通过2D培养中的FRSK（I）或类器官培养来模拟体内分化（II），这通过GPCR激活实现，据推测包括hCG与其受体LHCGR的结合。腺苷酸环化酶（AC）的活通过将ATP转化为cAMP来诱导STB分化，激活蛋白激酶A（PKA），进而激活MAPK级联反应，最终通过磷酸化激活CREB和ATF-1转录因子（TF），并结合到cAMP反应元件（CREs，红色DNA基序）。CRE motif的DNA甲基化会阻断CREB:ATF-1的结合，而DNMT表达的缺失被认为会导致CRE motif的非甲基化。由MAPK激活的对甲基化不敏感转录因子（蓝色）可以结合到目标motif。
- 免疫荧光图像显示与对照hTSC类器官相比，DNMT3L-OE hTSC类器官中的CDH1和SDC1。
- 条形图显示DNMT3L-OE和对照hTSC类器官中STB面积相对于总类器官面积的比例。
- western blot显示与对照组相比，DNMT3L-OE hTSC类器官中的HSP90、DNMT3L、pCREB（Ser133）、pATF-1和总CREB丰度。左侧图表显示CREB条带强度的定量。与对照组相比，DNMT3L-OE hTSC类器官显示出CREB蛋白水平的降低。
- 免疫荧光图像显示了对照和DNMT3L-OE hTSC类器官中的pCREB和SDC1。
- 显示了被ATF-1结合的经典CRE motif，其中包含一个中心CpG位点。
- 条形图显示通过RT-qPCR检测DNMT3L-OE和对照hTSC类器官中上皮细胞标记物CDH1和STB标记物SDC1、GCM1、CGB、CGA、ERVW-1（SYNCYTIN-1）以及ERVFRD-1（SYNCYTIN-2）的相对表达。
结论和启示
本研究揭示了hTSCs的DNA甲基化模式与原代滋养层细胞的显著差异，并通过DNMT3L的异位表达恢复了胎盘PMDs。研究结果表明，DNMT3L在胎盘PMDs的建立中起着关键作用，而其在hTSCs中的缺失可能是导致DNA甲基化模式异常的主要原因。此外，DNMT3L过表达的hTSCs在类器官培养中表现出分化能力受损，这可能与CREB结合位点的DNA甲基化增加有关。这些发现为理解胎盘发育的表观遗传调控提供了重要信息，并为研究胎盘相关疾病提供了新的模型和方法。
微量WGBS技术的作用
微量WGBS技术在本研究中发挥了关键作用。它允许研究者对少量细胞样本进行全基因组DNA甲基化分析，揭示了hTSCs与原代滋养层细胞之间的DNA甲基化差异。这一技术的应用不仅提高了研究的分辨率，还为研究胎盘发育的表观遗传调控提供了新的工具。未来，类似的研究可以利用微量WGBS技术，深入探索其他细胞类型和组织的DNA甲基化模式，揭示其在发育和疾病中的作用。
目前，易基因科技有限公司在DNA甲基化修饰等表观遗传检测领域，积累了一系列国际先进技术，可对高通量单细胞甲基化组学研究，微量DNA甲基化测序，ctDNA、FFPE等严重降解痕量DNA甲基化检测等，提供多种有效解决方案。低成本、高通量的单细胞甲基化组学测序技术建立，将为研究者对不同时间和空间的单细胞表观修饰研究奠定基础。
- 微量细胞或单细胞全基因组甲基化测序(Micro DNA-WGBS)DNA起始量：
单细胞/100-1000个细胞
1ng基因组DNA
90%以上基因组CG覆盖 - 微量细胞或DNA简化基因组甲基化测序(Micro DNA-RRBS)DNA起始量：
1ng基因组DNA；
10-20M有效CG位点覆盖；
10-20G测序数据量； - 微量cfDNA简化基因组甲基化测序(cfDNA-RBS)
100ul血浆或1ng cfDNA
10M有效CG位点覆盖
15-20G测序数据量
易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化、cfDNA）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、RNA与蛋白互作）、DNA与蛋白互作及染色质开放性技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），更多表观组学或多组学研究可关注易基因公众号、网站、市场微信号等，期待与各位老师开展合作交流，详询易基因：0755-28317900。
参考文献：
Lea G, Doria-Borrell P, Ferrero-Micó A, Varma A, Simon C, Anderson H, Biggins L, De Clercq K, Andrews S, Niakan KK, Gahurova L, McGovern N, Pérez-García V, Hanna CW. Ectopic expression of DNMT3L in human trophoblast stem cells restores features of the placental methylome. Cell Stem Cell. 2024 Dec 31. doi: 10.1016/j.stem.2024.12.007.
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