当前位置: 首页 > news >正文

原核表达可溶性蛋白难题破解

原核表达可溶性蛋白难题破解

在生物医药、疫苗研发、结构生物学和酶工程等领域,重组蛋白的表达与纯化是基础性技术之一。其中,原核表达系统因其高效、成本低廉而成为研究和工业生产中的首选平台。然而,如何获得高可溶性、功能完整的重组蛋白,仍然是科研人员面临的重大挑战。

IMG_256

一、原核表达系统概述

原核表达系统主要以大肠杆菌(Escherichia coli)为代表,利用其快速的生长速度和高效的蛋白合成能力,进行外源基因的表达。该系统的优势包括:培养条件简单、表达量高、成本低廉、操作简便。然而,原核系统也存在一些局限性,尤其是在表达高分子量、复杂结构或具有翻译后修饰需求的蛋白时,往往导致蛋白质聚集形成包涵体,影响其可溶性和功能性。因此,如何提高原核表达系统中蛋白的可溶性,成为了研究的热点。

二、影响原核表达可溶性蛋白的因素

1. 蛋白质本身的特性

蛋白质的氨基酸序列、分子量、疏水性、二级结构等特性直接影响其在原核系统中的表达和溶解性。高疏水性、丰富的β-折叠结构和大分子量的蛋白更容易形成包涵体。

2. 表达载体与启动子系统

表达载体的选择、启动子的强度以及诱导条件都会影响蛋白的表达水平和溶解性。强启动子和高诱导浓度虽然能提高表达量,但也可能导致蛋白快速积累,增加包涵体的形成。因此,优化表达载体和启动子系统,合理控制诱导条件,是提高蛋白可溶性的关键。

3. 培养条件

培养温度、培养基成分、诱导时间和诱导剂浓度等因素都会影响蛋白的表达和溶解性。较低的培养温度有助于蛋白的正确折叠,减少包涵体的形成。例如,采用低温诱导策略,可以促进蛋白溶解,增加可溶性蛋白的几率。

4. 蛋白折叠辅助系统

分子伴侣如GroEL/GroES、DnaK/DnaJ等在蛋白质的正确折叠中起着重要作用。共表达这些分子伴侣可以提高重组蛋白的溶解性和活性。例如,采用共表达GroEL/GroES系统可以显著提高重组蛋白的可溶性和活性。

5. 包含体的处理与溶解

对于已形成的包涵体,采用适当的溶解和重折叠方法,如使用尿素或硫脲溶解包涵体,再通过透析或快速稀释等方法进行重折叠,可以获得具有生物活性的蛋白。然而,稀释复性的复性率低,且存在因二硫键错配导致构象不正确的问题,导致生物学活性降低。

三、解决策略与研究进展

1. 优化表达条件

通过调节培养温度、诱导时间和诱导剂浓度等条件,可以在一定程度上提高蛋白的溶解性。例如,降低培养温度至15-20℃,延长诱导时间,有助于蛋白的正确折叠。

2. 蛋白工程改造

通过基因工程手段,优化蛋白的氨基酸序列,如减少疏水性区域、增加亲水性区域、引入可溶性标签等,可以提高蛋白的溶解性。

3. 共表达分子伴侣

共表达分子伴侣如GroEL/GroES、DnaK/DnaJ等,可以促进重组蛋白的正确折叠,减少包涵体的形成。

4. 包含体的溶解与重折叠

对于已形成的包涵体,采用适当的溶解和重折叠方法,可以获得具有生物活性的蛋白。

5. 新型表达系统的开发

近年来,研究者们开发了多种新型表达系统,如酵母表达系统、昆虫细胞表达系统等,这些系统在某些情况下可以克服原核系统的局限性,获得高可溶性和高活性的重组蛋白。

四、融合标签策略

在原核表达系统中,蛋白质往往因为疏水性高、结构复杂而难以溶解。融合标签(Fusion Tag)技术被广泛应用,常见的可溶性标签包括GST、MBP、SUMO等。融合标签通过改善折叠环境、增加亲水性和提供纯化功能,提高目标蛋白的可溶性和纯化效率。例如,在表达人干扰素α2b(hIFN-α2b)时,通过在N端融合MBP标签,可溶性蛋白量从约10%提升至60%以上,并保持抗病毒活性(Waugh, 2011)。需要注意的是,标签去除后可能影响蛋白稳定性或活性,标签与目标蛋白之间应设计合理的酶切位点。

五、低温诱导与分步表达

低温表达和分步诱导策略是提高蛋白可溶性的经典方法。降低表达温度可减缓翻译速度,使蛋白有更多时间正确折叠,降低聚集速率,并有利于分子伴侣参与折叠。实验显示,将大肠杆菌培养温度从37℃降低至16℃,可显著提高人干扰素β(hIFN-β)的可溶性表达。

分步诱导策略可进一步优化蛋白表达:初期使用低浓度诱导剂启动蛋白表达,随后逐步增加诱导剂浓度,控制翻译速率,提高可溶性。表达含多个二硫键的人胰岛素前体时,采用低温加分步诱导策略,可使可溶性蛋白率由约20%提升至65%,并成功进行体外折叠和活性检测。

低温表达与融合标签策略结合使用效果最佳,例如在表达复合酶或抗体片段时:N端融合MBP标签、低温诱导表达、共表达GroEL/GroES伴侣,能够显著提高可溶性表达量,同时保持蛋白功能。

http://www.hskmm.com/?act=detail&tid=16827

相关文章:

  • 深入解析:Adobe Fresco下载教程Adobe Fresco 2025保姆级安装步骤(附安装包)
  • Torch中的tensor size
  • Codeforces 1053 (Div.2)
  • 抗体药物偶联物(ADCs)生物分析:拆解 “靶向导弹” 体内轨迹的核心技术
  • 详细介绍:微服务的适用边界:从金融科技到量子计算的架构哲学
  • 使用IOT-Tree整合复杂计算模型(含AI模型),并对接现场设备优化控制(节能提效)技能方案
  • 为什么应该测试无JavaScript的页面体验
  • 前台部分数据不显示
  • 指针定义以及二维数组内存地址(java/c++/python)
  • 解码数据结构线性表之顺序表
  • 中电金信:源启数据集成平台全新升级,实现便捷与性能双飞跃
  • Jupyter NoteBook / Jupyter Lab的安装与使用
  • 完整教程:科技的温情——挽救鼠鼠/兔兔的生命
  • 易基因:Nat Rev Drug Discov/IF101.8:何川团队顶刊综述RNA修饰系统作为疾病治疗靶点的研究进展
  • 国产适配 + AI 一键生成!亿图图示 14.5 全平台绘图指南:260 种图表 + Visio 兼容,开发者 / 办公党速藏
  • 关闭Cadence Allegro Design Entry CIS(OrCAD Capture)的Start Page
  • Mini L-CTF 2025 WP
  • K8S APIServer压力高,导致控制器Leader续约失败而重启问题
  • 【2025-09-24】连岳摘抄
  • 8K 视频修复提速 50%!Topaz Video AI 7.0.0 实战指南:AI 增强 + 本地化模型 + GPU 加速全解析
  • Qwen 发布高精度实时音视频同传模型;AirPods 实时翻译功能新增中文丨日报
  • vivo 浏览器福利体系架构演进之路
  • 2024JCR最新完整版期刊名单!【附带21-23年完整版表格】
  • ESP8266+CH340+SG90舵机远程控制开关
  • 【ACM出版、连续三届EI检索】第四届人工智能与智能信息处理国际学术会议(AIIIP 2025)
  • 08_多线程编程
  • VisionPro学习笔记- PMAlignTOOL
  • FeignClient提示No subject alternative DNS name matching配置SSL
  • 【组合数学基础9】Catalan数(卡特兰数)笔记
  • 详细介绍:npm玩转技巧