在分子生物学研究中，转录因子与 DNA 的相互作用是基因表达调控的核心环节 —— 比如肿瘤抑制基因 p53 通过结合特定 DNA 序列调控细胞凋亡，植物 bHLH 家族转录因子通过结合启动子调控花青素合成。而酵母单杂交（Yeast One-Hybrid, Y1H）技术，正是研究这种 “蛋白 - DNA 互作” 的经典工具，它基于转录因子的 “DNA 结合域（BD）- 激活域（AD）分离特性”，在活酵母细胞内模拟天然调控场景，实现对互作的特异性验证与亲和力分析。本文将从原理、实验流程、结果解析三方面，带您系统掌握这项技术。
一、核心原理：转录因子的 “拆分与重构”
要理解酵母单杂交，首先需明确转录因子的工作逻辑：一个完整的转录因子包含BD（DNA 结合域） 和AD（转录激活域） ——BD 负责识别并结合基因启动子上游的特定 DNA 序列，AD 则通过招募转录机器激活下游基因表达。两者需在空间上靠近，才能共同完成转录激活。
酵母单杂交正是利用这一特性，将 “转录因子功能” 拆分为两部分：
- 目标 DNA 与报告基因偶联：将待研究的 DNA 序列（如基因启动子片段）克隆到载体中，下游连接报告基因（如 URA3、LEU2 等营养缺陷型标记，或 GFP 荧光蛋白），构建 “DNA - 报告基因载体”。当该载体进入酵母后，目标 DNA 序列可被转录因子的 BD 识别，但因缺乏 AD，无法激活报告基因。
- 转录因子单独表达：将待验证的转录因子基因克隆到另一载体中，该载体含强启动子（如 ADH1 启动子），可驱动转录因子在酵母内高效表达。若该转录因子能结合目标 DNA，其自身的 AD（或融合的 AD）会与 BD 靠近，激活报告基因表达 —— 通过报告基因的 “是否表达”，即可判断转录因子与 DNA 是否存在互作。
二、实验流程：从载体构建到阳性筛选的四步走
酵母单杂交实验需严格控制实验条件，确保结果的特异性与可靠性，核心流程可分为四步：
1. 载体构建：精准克隆目标序列与转录因子
- DNA - 报告基因载体构建：
首先确定待研究的 DNA 序列（如 VvMYB1 基因的启动子区域，或 p53 的结合元件），通过 PCR 扩增后，定向克隆到酵母表达载体（如 pGBKT7）中 —— 该载体的报告基因通常为营养缺陷型标记（如 HIS3），且目标 DNA 序列需插入报告基因启动子上游，确保转录因子结合后能启动报告基因。 - 转录因子表达载体构建：
克隆待验证的转录因子基因（如植物 VvbHLH036、人类 p53），插入含强启动子的载体（如 pGADT7）中，无需融合 BD（因转录因子自身含 BD），但需确保蛋白能在酵母内正确折叠（可添加核定位信号优化定位）。
2. 酵母转化：将两种载体导入同一细胞
选择合适的酵母菌株（如 Saccharomyces cerevisiae AH109），采用 “醋酸锂转化法” 将上述两种载体同时导入酵母细胞 —— 酵母细胞需先经预处理（如 LiAc 处理）增加细胞膜通透性，确保质粒顺利进入。转化后，在含抗生素的选择培养基（如含氨苄青霉素）上培养，初步筛选出 “同时携带两种载体” 的转化子（仅成功转化的酵母才能存活）。
3. 筛选培养：通过营养缺陷筛选阳性克隆
将初步筛选的转化子接种到营养缺陷型培养基（如缺乏组氨酸的 SD/-His 培养基）中培养：
- 若转录因子能结合目标 DNA，会激活报告基因（如 HIS3）表达，酵母可在缺乏组氨酸的培养基上生长；
- 若两者无互作，报告基因不表达，酵母因无法合成组氨酸而死亡。
为排除非特异性结合，可在培养基中添加3 - 氨基 - 1,2,4 - 三唑（3AT） ——3AT 能抑制 HIS3 基因的基础表达，只有转录因子与 DNA 结合较强、能高效激活报告基因的酵母，才能在含 3AT 的培养基上生长，进一步提高筛选严格性。
4. 对照设置：确保实验系统的有效性
对照实验是酵母单杂交的关键，需设置两类对照排除假阳性 / 假阴性：
- 阳性对照：使用已知存在互作的 “转录因子 - DNA 组合”（如 p53 与 p53 结合元件），若阳性对照能在选择培养基上生长，说明实验系统正常；
- 阴性对照：使用不相关的转录因子（如绿色荧光蛋白 GFP）或随机 DNA 序列，若阴性对照无法生长，说明无明显非特异性结合，实验结果可靠。
三、结果解析：从 “生长与否” 到 “互作强度”
酵母单杂交的结果需从 “定性” 和 “定量” 两方面分析，才能全面解读转录因子与 DNA 的互作特性：
1. 定性判断：是否存在特异性互作
通过观察酵母在选择培养基上的生长情况判断：
- 实验组（如 pGBKT7 - 启动子 + pGADT7-VvbHLH036）若能在 SD/-His+3AT 培养基上生长，且阴性对照（如 pGBKT7 - 启动子 + pGADT7-GFP）不生长，说明 VvbHLH036 与目标启动子存在特异性互作；
- 若实验组与阴性对照均不生长，可能是转录因子不结合目标 DNA，或载体构建有误（如基因插入方向错误），需排查载体序列与转化效率。
2. 定量分析：互作亲和力与结合位点
- 亲和力评估：通过梯度增加 3AT 浓度（如 10mM、20mM、50mM）观察酵母生长情况 —— 能在更高 3AT 浓度下生长的组合，说明转录因子与 DNA 的结合亲和力更强（需激活更多报告基因才能抵抗 3AT 抑制）；
- 结合位点定位：若需确定转录因子结合的具体 DNA 片段，可将目标 DNA 序列截断为不同片段（如 5' 端截断、3' 端截断），分别构建载体后重复实验 —— 仅能与 “特定截断片段” 结合的组合，可锁定转录因子的核心结合位点（如 bHLH 家族的 E-box 元件）。
四、技术优势与应用场景
酵母单杂交的核心优势在于 “在活细胞内模拟天然互作环境”，避免了体外实验（如 EMSA）中蛋白变性、DNA 构象改变的问题，尤其适合：
- 验证已知转录因子与目标 DNA 的互作（如临床研究中 p53 突变体与靶序列的结合能力变化）；
- 筛选能结合特定 DNA 序列的未知转录因子（如从植物 cDNA 文库中筛选结合花青素合成基因启动子的转录因子）；
- 分析转录因子的结合特异性（如比较不同 bHLH 成员对同一启动子的结合偏好）。
泰克生物提供分子互作研究技术支持，涵盖酵母单杂交载体构建、酵母转化与阳性筛选，助力转录因子 - DNA 互作机制研究与验证。